摘要:五味子糖浆收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第02册。原标准仅收载了对五味子的理化鉴别。根据国家中药品种申报的要求,在原标准的基础上,增加了五味子中五味子甲素的含量测定和五味子中五味子甲素薄层鉴别。
　　关键词:高效液相色谱法;五味子糖浆;五味子甲素;含量测定
　　
　　1 含量测定
　　
　　1.1 仪器、试药及试剂
　　仪器:Waters2996高效液相色谱仪、HP1100高效液相色谱仪、AE-240电子天平 、SK2200HP型超声波振荡仪。
　　色谱柱:YMC-Pack ODS-A (5μm.. 4.6mm×150mm)。
　　对照品:五味子甲素(中国药品生物制品检定所提供)(批号:110764-200107)
　　试剂:甲醇 色谱纯
　　试药:五味子糖浆(哈药集团中药二厂)
　　1.2 检测条件的选择
　　波长选择:取五味子甲素对照品适量,加甲醇溶解,用Waters 2996检测器进行全波长扫描,在250 nm处有最大吸收,故其最大吸收峰位于250nm处,与《中国药典》2005年版一部五味子药材项下的含量测定标准一致,因此将检测波长定为250nm。
　　流动相的选择:先后试用甲醇-水(50:50)、甲醇-水(60:40)、及甲醇-水(75:25)三种比例的流动相。流动相为甲醇-水(60:40)和甲醇-水(75:25)时,成品中五味子甲素峰分离不开;流动相为甲醇-水50:50)时,成品中五味子甲素与其它组分均能达到基线分离。
　　检测条件:根据上述考查的结果,确定流动相为甲醇-水(50:50),检测波长为250nm。
　　在上述条件上,样品中五味子甲素与其它成分能达到较好的分离,分离度大于1.5。
　　阴性干扰试验:在处方中去五味子药材,按方中比例和制备工艺方法制成阴性制剂,用供试品溶液制备的方法,制成阴性对照溶液。用以上选定的测定条件进行吸收曲线绘制,观察在与五味子甲素相同的保留时间处是否存在吸收峰,结果表明:在选定条件下测得的阴性液吸收曲线在与五味子甲素相同保留时间处不存在吸收峰,因此说明选定的条件测定五味子甲素无干扰,具有较强的专属性。
　　1.3 提取方法确定
　　1.3.1 提取溶媒的选择
　　在供试品溶液制备中,分别选用了水、50%甲醇、甲醇进行超声提取,含量结果见表1:
　　结果表明:甲醇分离效果、峰形及含量均为最好,所以选择甲醇进行超声提取。
　　1.3.2 提取时间的选择
　　取供试品适量,用甲醇溶解,超声波振荡分别提取10、20、30分钟,制备供试品溶液,含量结果见表2:
　　结果表明:三种提取时间结果无明显差异,为保证提取完全并缩短处理时间,采用超声提取10分钟。
　　1.3.3 样品的取样量的选择
　　分别精密量取3ml、5ml、10ml,置50ml容量瓶中,加入甲醇溶液40ml,超声处理10分钟,放置至室温,用甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。(见表3)
　　结果表明:三种提取结果无明显差异,取3ml、10ml的信噪比没有称取5ml的低,所以采用量取5ml样品。
　　由上述实验可以确定供试品溶液的制备方法为: 取本品装量差异项下内容物,精密量取5ml,置50ml容量瓶中,加入甲醇溶液40ml,超声处理10分钟,放置至室温,用甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。
　　1.4 含量测定的方法学考察
　　1.4.1 仪器精密度试验
　　取本品装量差异项下内容物,精密量取5ml,置50ml容量瓶中,加入甲醇溶液40ml,超声处理10分钟,放置至室温,用甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液,连续进样6次,结果见表4:
　　1.4.2 对照品的线性关系考察
　　精密称取五味子甲素对照品6.80mg,置100ml量瓶中,用甲醇溶解,稀释至刻度,摇匀。进样量分别为4、6、8、10、12、14、16μl,按含量测定方法测定峰面积,并以峰面积的积分值为横坐标,对照品进样量为纵坐标建立标准曲线,计算回归方程,数据见表5:
　　回归方程为:Y=X×0.000000794+0.001030341(r=0.9999),五味子甲素在0.152μg～0.608μg范围内呈良好的线性关系。
　　1.4.3 重现性试验。分别称取同批五味子颗粒样品6份,按质量标准含量测定项下方法测定含量,并计算样品的RSD值,结果见表6:
　　由表6可见,此含量测定方法的重现性良好。
　　1.4.4 准确度试验
　　对照品溶液配制:取五味子甲素8.06mg,甲醇溶解并定容至25ml,摇匀,即得。本对照品溶液浓度为0.3224mg/ml。
　　精密称取已知含量(含量为0.25mg/ml)的样品6份,每份约1.5ml,分别加入五味子甲素对照品溶液1.5ml(相当于对照品0.48mg),按质量标准含量测定项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液,并测定含量,计算回收率。
　　1.4.5 稳定性试验。取同一供试品,按正文含量测定方法测定后,样品置室温下放置,每间隔2小时测定1次,连续测5次,测定结果的RSD=0.30%。证明供试品制备后8小时内测定结果稳定。
　　1.4.6 含量限度的确定。按本品质量标准含量测定项下方法,测定了三批样品,结果见表7。
　　结果表明,样品中五味子甲素的含量差异,每毫升样品含五味子以五味子甲素计均大于0.20mg,因此规定五味子糖浆中含五味子以五味子甲素计均大于0.20mg/ml。即每瓶五味子糖浆(规格100ml)含五味子甲素不低于20mg。
　　
　　2 增加五味子鉴别
　　
　　对照品溶液的制备:取五味子甲素对照品。加甲醇制成每1ml含2mg的溶液,作为对照品溶液。供试品溶液的制备:取五味子糖浆20ml,用水饱和正丁醇萃取3次,每次15ml,取水饱和正丁醇层,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解.作为供试品溶液。
　　阴性样品溶液的制备:在处方中去五味子,按方中比例和制备工艺方法制成阴性制剂,用供试品溶液制备的方法,制成阴性对照溶液。
　　方法:照簿层色谱法(附录Ⅵ B)试验,吸取上述两种溶液各2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-甲酸(20:10:1)的上层溶液为展开剂,展开.取出,晾干,置紫外灯(254nm)下检视.供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。