摘要:本文主要研究适合于浓醪发酵的酵母菌种的选育。以实验室自备的酵母菌为出发菌株,进行紫外线诱变处理和杂交处理,选育出产酒率高的菌株c紫外线诱变处理时-不改变紫外线照射波长和照射距离,通过照射时间的不同处理菌种,然后进行浓醪发酵试验,选育出适合于浓糖化醪发酵的高产酵母菌J-l-l-3:该菌株在料水比1:2的发酵液中,温度325±1℃,发酵85-96h的奈件下,产酒率达到14.1%( v/v)。
关键词:浓醪发酵;诱变;杂交;育种
1前言
酒精作为食品、化工原料,用发酵法生产酒精是最重要的微生物生产工业之一。20世纪70年代中期,许多科学工作者开始致力于应用生物工程技术开发酒精发酵的新菌种、新工艺,以固定化细胞技术实现连续发酵的研究相当活跃,但这项技术应用于酒精生产仍存在局限性。选育高产酒精菌种,直接应用于生产仍是人们努力的方向。
利用诱变剂处理微生物细胞,使其细胞内遗传物质在结构上发生变化,从而使微生物遗传性状改变。然后根据育种要求,选出具有一定实用价值的变异菌株。人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱,具有速度快、方法简单等优点,是当前菌种选育的一种主要方法,在生产中使用的十分普遍。
提高发酵浓度是发酵工业技术革新的一个主要方面和简单有效的手段。酒精浓醪发酵是提高发酵强度的重要措施,因为它是在发酵罐容积不变的前提下,提高发酵成熟醪酒精浓度的。另外,提高发酵浓度后,可以在基本不改动现有设备的情况下提高设备利用率.减少人工和能耗,减少工艺用水量,缩短发酵周期,减少发酵罐清洁费用,减少DDGS蒸发量,从而大幅度地降低生产成本。因此酒精浓醪发酵一直是近年来研究的热门课题。
2材料和方法
2.1菌种:高级活性干酵母(湖北安琪酵母股份公司)实验室自备酵母菌葡萄酒菌
2.2培养基
2.2.1酵母复状培养基/g.Lˉ:葡萄糖4.0酵母膏0.5,硫酸锌0.14.硫酸镁0.32,琼脂2.0。
2.2.2分离培养基/g.Lˉ:葡萄糖2.0,磷酸0.1,硫酸镁0.05,硫酸锌0.14,酵母膏0.1.琼脂2,硫酸铵0.05,PH 6.O。
2.2.2 杂交培养基/g.Lˉ:葡萄糖4.酵母膏0.5.硫酸锌0.14.硫酸镁0.32,琼脂2.PH5.4。
2.2.3 发酵培养基:玉米面和水按重量以1:2的比例混合,水浴加热.60℃时按0.008g/ml加入液化酶,且保持600C半小时;后升温至90℃,保持90℃2小时;降温至700C,加糖化酶和营养盐(磷酸,尿素,硫酸锌,硫酸镁).半小时后调PH=4.3;然后降温至35℃备用。
2.3诱变育种
2.3.1制酵母单孢子菌悬液
取已培养好的酵母菌斜面(试管斜面),加入4ml无菌水,把孢子轻轻括下,将其倒入已灭菌盛有玻璃珠的三角瓶中,振荡20分钟,用带有无菌脱脂棉的漏斗过滤,即得分散较好的单孢子悬浮液。
2.3.2紫外诱变操作
(1)倒平板:在直径9cm的碟子中,每只倒入分离培养基,放平,冷却。
(2)吸取单孢子悬浮液Sml于已灭菌的直径为5cm的碟子中,进行紫外照射。将装有菌液的碟子放入紫外箱中,首先打开电磁搅拌器,然后打开碟子盖,最后将紫外灯打开,开始计时。照射结束,关闭紫外灯,将碟子盖上,从紫外箱中取出。[紫外灯固定波长(用15瓦灯管);照射距离30cm。
(3)稀释:从照射碟子中吸取0.5ml菌液,加入4.5ml的无菌水中,摇匀。依次稀释至所需浓度。
(4)分离:将上述稀释好的液体,每个吸取O.lml放入培养基已冷却凝固的碟子中,每个浓度做1个碟子,然后用涂布棒将菌液均匀涂遍整个爹则,最后将碟子倒置入32.5℃培养箱中培养5-7天。
2.4分析方法
2.4.1酵母菌体生长量测定方法:细胞计数方法:采用血球计数板计数法。
2.4.2粗淀粉测定:玉米粉经水解处理后用斐林氏试剂法测定。
2.4.3还原糖测定:斐林氏试剂法测定。
2.4.4总糖测定:样品经水解处理后用斐林氏试剂法测定。
2.4.5挥发酸测定:用氢氧化钠滴定法测挥发酸度。
2.4.6酒份测定
取滤液和蒸馏水各100ml于500ml三角瓶中蒸馏,馏出液95ml,用蒸馏水补加到100ml,用酒度计测定,同时测定温度,并用酒精度与温度换算表,换算成20℃时的酒精度。
3结果与分析
3.1菌种形态特征
在显微镜下观察酵母菌涂片,细胞程圆形或椭圆形,多边出芽生殖。在复状培养基上菌落颜色呈乳白色,有突起,表面干燥,有皱折。
3.2紫外线诱变处理
紫外线诱变的原理是通过紫外线灯照射使微生物的DNA发生变化。把所选的酵母菌放入培养皿中,置于紫外线灯下诱变,灯距30厘米。紫外线诱变处理时间与致死率的关系见表3-1不同照射时间的致死率
由表3-1可以明显看出随看照射时间的增加,紫外线照射致死率呈明显的上升趋势。而最佳照射时间是35s-45s,死亡率在90%以上。
3.3菌种产酒能力分析
3.3.1紫外线照射与产酒率关系讨论
(1)选取菌种各照射时间稀释-5次作图3-2:
从图3-2中可明显看出,相对来说照射30s的菌种产酒率最低;而其它照射时间的产酒率都相差不太大,产酒率都比较高,在11.9%(V/V) -13.7%l v/v)之间酒率。产酒率最高的是照射照射35s的菌种,达到13.7%(V/V)。
3.3.2杂交育种分析
选取诱变后产酒率相对较高的几株酵母菌与葡萄酒菌杂交培养,然后进行发酵试验,菌种杂交后再照射的产酒率并没有一个固定的变化趋势。但总的来说,杂交后再照射的产酒率不高,在7.7%(v/v) -11.2%(v/v之间,这说明就产酒率而言,杂交后再照射的效果没有只照射的效果好。因此选育菌种时不采用杂交后再照射的方法。
4结论
4.1 酵母菌经紫外线诱变后,可选育出适合于浓糖化醪发酵的高产酵母菌。
4.2 总的来说,试验中所选的紫外线照射时间比较合理。
4.3 相对来说,菌种照射30s的产酒率比较低;而最佳照射时间是35s-45s。产酒率最高的是菌种照射40s.达到14.1%(v/v)。
4.4 菌种杂交后再照射的产酒性能不如只照射的菌种,因此杂交后再照射的方法不宜选用。
参考文献
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